黑木耳母种培养基配制后的接种与培养

1、固体菌种的生产：

固体菌株是菌丝体在固体培养基中生长形成的固体形态菌株。试管原液（第1 类）菌株通常分为3 类。 1类种也称母种或试管种，可通过组织分离或孢子分离获得。二级种也称原种，是将母种的菌丝插入木屑培养基中产生的菌种。第3类种也称栽培种，是利用原种再次繁殖产生的菌株。直接用于生产，故又称生产种。经过母种-原种-栽培种的不断扩大繁殖，菌丝体的数量越来越多，越来越壮大，利用这样的菌丝体投入生产，可以长出优良的子实体。

母种培养基的制备：

(1)常用配方：土豆200克，白糖20克，琼脂20克，水1000毫升。为加强营养，有条件的生产者可在上述培养基中加入蛋白胨3.0克、磷酸二氢钾3.0克、硫酸镁1.5克。

(2)制法：先将土豆去皮、切片，用水煮熟，半熟后取汁，小火加热取汁，加入琼脂、白糖。融化后，将培养基放入规格为18mm180mm的试管中，培养基高度为试管长度的1/4或1/5。分装后，试管用棉塞塞紧，每7管扎成一捆，用牛皮纸包好，准备灭菌。

(3)培养基灭菌：用便携式高压蒸汽灭菌器或家用高压锅灭菌，压力0.12MPa(锅内温度121)灭菌40分钟。当温度降至60时，取出摆斜面，斜面的长度最好占管长的2/3左右。

2.菌株分离扩增培养：

菌株分离方法包括孢子分离法、组织分离法和真菌分离法。孢子分离法是选择当年出生的新鲜耳片，没有被细菌污染，最好是黑色、厚实、大的。用无菌水清洗数次后，用丝线将耳承腹面朝下，另一端挂在容器上。装有培养基的三角瓶口用棉塞密封，孢子接收于25-28培养箱中培养成菌丝体。组织分离法是选用优质耳片，用75%的酒精棉球擦拭表面23次，用酒精棉包住耳片约2分钟，并在离耳朵约0.2平方厘米处切开基部无筋。在无菌条件下，接上试管的斜面培养基，在28左右的温度下培养长出菌丝。

真菌分离法是将黑木耳的菌丝体分离得到菌种。剪下火柴头大小的木块，消毒后，在无菌条件下插入试管斜面，25-28培养后长出菌丝体。分离菌种时，应在接种箱内或接种室的超净工作台上进行无菌操作，防止杂菌污染。分离几天后，试管斜面上会长出白色蓬松的黑木耳菌丝。经过10天左右的培养，菌丝可以长满坡面，这就是母种。试管母种分离成功，也可在试管斜面培养基上扩繁13次。这个过程称为管转移或扩管，也称为通道。一般1个雌性种子可调成30-40个雌性种子，以满足生产需要。

3、原种和栽培种的生产：原种和栽培种的培养基通用，种类繁多。下面只介绍常用的木屑介质：

(1)培养基配方：培养基常用配方为阔叶木片78%、麦麸或米糠20%、蔗糖1%、石膏1%。

(2)制备方法：先将木屑过筛，将木屑、麦麸或米糠、石膏混合均匀，再加入融化的糖水混合，使堆肥含水量达到60%左右。判定方法是用手紧握堆肥，指缝间有轻微水印，不滴水。

(3)中型装瓶装袋：一般用瓶装原种。培养基配制好后，即可放入制种瓶中，灌至瓶肩，将物料表面压平。堆肥在瓶中要拧紧拧松，中间用木锥扎一个洞。瓶口内外清洁，广口瓶用亚克力膜或乙烯基膜加胶圈密封（亚克力膜适用于高压蒸汽灭菌，乙烯基膜适用于常压蒸汽灭菌），小口瓶要用棉塞密封。栽培品种一般采用塑料袋生产，聚乙烯袋适用于常压蒸汽灭菌，聚丙烯袋适用于高压蒸汽灭菌。袋子的尺寸更适合33 cm x 17 cm x 0.005 cm。装袋时，要保证适当的松紧度。装袋后套上衣领，插入接种棒，用棉塞塞紧或用专用塑料盖封好。装袋时要轻拿轻放，防止沙粒或杂物刺破袋子造成污染。

(4)培养基灭菌：将原种和栽培种的培养基装瓶装袋，放入铁筐或塑料筐中进行灭菌。灭菌方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。使用常压蒸汽灭菌时，锅内温度达到100后应保持8小时以上。采用高压蒸汽灭菌时，锅在压力0.15MPa（锅温127）下灭菌1.5小时。常压蒸汽灭菌器可自建，高压蒸汽灭菌器或灭菌器必须从正规厂家购买，以确保安全生产。

4、接种培养：

(1)接种：灭菌后的瓶或袋，物料温度降至30以下后，移入接种箱、接种帐或接种室进行接种。接种前，将接种用具和物品搬入接种点。这些器具和物品主要包括接种勺、镊子、酒精灯、酒精棉球、菌种、待接种材料袋等。物品收好后，用气雾消毒剂熏蒸，40分钟后即可使用。原种是母种在原种培养基上扩增得到的菌株，栽培种是原种在栽培种培养基上扩增得到的菌株。用原种接种栽培种时，先拔出料袋中的接种棒，再接种。

(2)栽培：栽培场地使用前也应用气雾消毒剂熏蒸。温度控制在25-28，空间适宜的相对湿度为60%左右。菌种应避光培养，经常通风。在培养过程中，需要经常检查是否有细菌污染。待菌种生长良好后，将其存放在低温、干燥、清洁避光处，以备使用。此外，栽培品种不宜扩大繁殖。

5、无菌接种操作规程：首先将接种箱和接种室清理干净，放入培养基、菌种、接种器具。使用气雾消毒粉进行熏蒸消毒，每立方米空间使用1包（5克），置于容器内点燃，放置40分钟以上。用75% 的酒精棉签擦拭双手。点燃酒精灯，待接种工具烧尽灭菌后开始接种。接种时需保持无菌操作，接种后将培养基移至培养室培养。